Свято-Духовский храм и возникший под его сенью монастырь в течение почти двух веков оставался единственным православным храмом в Вильнюсе. В этом храме в самые трудные минуты для православных раздавалось слово утешения святой веры. Здесь же поучал православных святитель Дмитрий Ростовский. Здесь за три года до избрания первосвятителем Русской Православной Церкви молился и возглавлял православных Литвы святитель Тихон. Наконец, в этом святом храме с давних пор находятся нетленные мощи святых Виленских мучеников Антония, Иоанна и Евстафия.

После заключения в 1596 году Брестской унии, предполагавшей не только объединение Литвы и Польши в одно государство, но и объединение православной и католической Церкви с признанием главенства Римского папы и догм католической Церкви, для православных Литвы наступили тяжелые времена. Все приходские церкви в Вильне были закрыты, Свято-Троицкий монастырь был отдан униатам. Но народ виленский боролся за свою святую православную веру. После многих отказов, в 1597 году Свято-Троицкое братство получило от короля Сигизмунда III разрешение построить новую церковь на Большой улице, почти напротив Св.Троицкой обители. Первоначально церковь была возведена из дерева, на земле, принадлежавшей двум именитым сестрам Феодоре и Дорофее-Анне, урожденным Волович, и ими передана в собственность братству, которое стало группировать около этой святыни свои силы и свои учреждения - училище, типографию, богадельни и т.п.

Училище, именуемое коллегией в научном отношении стояло довольно высоко. Оно состояло из пяти классов, и в нем преподавались все те же науки, что и в вильнюсской иезуитской академии. Первым ректором братского училища был первый настоятель Свято-Духова монастыря Леонтий Карпович. Здесь преподавал и известный Кирилл Лукарис, ставший потом константинопольским патриархом. Для студентов этого училища в 1618 году были составлены и напечатаны под Вильной первые в России "Словарь" и "Словенская Грамматика". По ним, как известно, и что составляет предмет гордости Вильны, учились тысячи людей, в том числе и великий Михайло Ломоносов. Параллельно с просветительством шла работа по возведению вместо деревянного - каменного храма, который "с благоукрашением внутренним соединил бы и представительность внешнюю..." Храм был полностью закончен к 1640 году. В руках православных Свято-Духов монастырь оставался всегда и в этом отношении он примечателен как единственная в Вильнюсе православная церковь, не бывшая в руках униатов. Свято-Троицкое братство еще в 1588 году от Константинопольского патриарха получило право ставропигии, т.е. оно непосредственно подчинено было Константинопольскому патриарху и не зависело от местной церковной власти. Переселившись из Троицкого монастыря, братство передало это право Св.-Духову монастырю, и потому все православные монастыри в Литве, мужские и женские, были подчинены Св.-Духову монастырю.

Из стен Свято-Духова монастыря вышло большинство епископов в Белоруссии. Были даже киевские митрополиты из монахов Свято-Духова монастыря. В том числе священномученик Макарий (+1497). Со времени основания монастыря и до подчинения края России в нем было более 70 настоятелей. С 1795 года настоятелями назначались архимандриты, а затем - архиепископы литовские. В церковном отношении храм с 1804 года причислялся к епархии Минской, а с 1833 года - к Полоцкой.

В Свято-Духовой обители принял пострижение в иночество преподобномученик Афанасий Брестский. Здесь же погребено обезглавленное в 1611 году на Виленской площади тело известного московского воеводы князя Данила Мышецкого, отстаивавшего в Вильнюсе власть русского царя и казненного по настоянию польской стороны. Московский боярин князь Голицын, захваченный под Смоленском в плен королем Сигизмундом и освобожденный из плена по Деулинскому договору, умер на пути в родную землю и был похоронен в Свято-Духовой обители.

В начале XVIII века шведы разорили монастырь и церковь. Большую материальную помощь в его восстановлении оказал в 1708 году Петр I. Частые опустошительные пожары, которым не раз подвергался Вильнюс, не щадили и Св.-Духова монастыря. В 1749 году он сгорел вместе с церковью. Остались одни стены. Впоследствии он был возобновлен.

Церковь сильно пострадала в 1812 году. Солдаты Наполеона устроили в ней кухню, испортили иконостас, сожгли царские врата, взломали полы, закоптили стены. После войны храм был приведен в наилучший вид - средства на это выделил виленский купец первой гильдии Александр Николаевич Слуцкий. Много потрудился на благо монастыря архимандрит Иоиль Котович. При нем Свято-Духов монастырь был влзведен в первоклассный.

Позднее вильнюсские архипастыри одновременно были и настоятелями монастыря. Первым таким настоятелем был известный всей России великий иерарх Русской Церкви архиепископ, а затем митрополит Иосиф Семашко. Он умер в 1868 году и похоронен в Свято-Духовской церкви, в пещерном храме. Его преемники - архиепископ Макарий, впоследствии митрополит Московский, архиепископ Александр и архиепископ Алексий продолжали заботиться об устройстве монастыря. Так, при архиепископе Макарии появилось общее отопление, а при архиепископе Алексии была заново отделана вся церковь и приведена в то состояние, в которов она находится теперь. Наружный вид церкви стал таким, каким мы его видим сегодня. В 1837 году, при императоре Николае I, из царской казны были выделены средства на ее переустройство. В 1852 году пещера, в которой с 1655 года хранятся мощи Виленских мучеников Антония, Иоанна и Евстафия, обращена в церковь их имени. Сооружен новый вход, над которым поставлен образ с изображением свв. Мучеников, пожертвованный Иваном Григорьевичем Сенявиным.     

В настоящее время Свято-Духов монастырь является центром православия в Литве. Монастырская церковь по сути дела является кафедеральным храмом, кроме того, в монастыре расположена резиденция митрополита Виленского и Литовского Хризостома. В этой святой обители подвизался и теперешний епископ Петропавловский и Камчатский Игнатий.

Св.-Духов монастырь имеет богатую библиотеку, где верующие имеют возможность читать православную литературу. При монастыре организовано заочное обучение в московском Православном Свято-Тихоновском богословском институте.